Dilahirkan di Florida, Missouri kepada pasangan John dan Jane Clemens, Samuel ialah anak keenam daripada tujuh adik beradik. Walau bagaimanapun hanya tiga orang adik-beradiknya yang melepasi zaman kanak-kanak sementara yang lainnya meninggal semasa kecil. Sewaktu beliau berumur empat tahun, keluarganya berpindah ke Hannibal, Missouri, sebuah bandar sungai, kerana mengharapkan ia dapat mengubah nasib mereka. Dari sinilah Samuel memperoleh bahan-bahannya untuk mencipta karya-karyanya yang termasyhur, khususnya novel "Pengembaraan Tom Sawyer" (1876).

Bapa Samuel meninggal dunia dalam tahun 1847 dengan meninggalkan banyak hutang. Tidak lama kemudian, abang sulungnya, Orion, memulakan sebuah penerbitan akhbar dan Samuel yang ketika itu hanya berumur 12 tahun menjadi pencetaknya dan sekali-sekala juga merupakan pengarangnya. Samuel juga mencari nafkah sebagai pencetak di St. Louis dan Bandaraya New York.

Bagaimanapun, tarikan Sungai Mississippi kemudian menyebabkan Samuel Clemens menjadi seorang malim bot api, satu pekerjaan yang ingin dijadikannya kerjaya seumur hidup, seperti yang tertulis dalam karyanya, "Kehidupan di Mississippi" (1883). Di sungai ini, Clemens bertemu dengan pelbagai jenis watak, termasuk seniman panggung, kaki judi, pendeta dan penjahat. Beliau mengatakan bahawa pendedahan itu amat membantu dalam pengarangan karyanya. Bagaimanapun, permulaan Perang Saudara Amerika Syarikat dan kemunculan landasan kereta api menamatkan lalu lintas komersil bot api pada tahun 1861, dan beliau terpaksa mencari punca pendapatan yang lain.

Selepas bertugas dengan tentera awam tempatan buat suatu tempoh yang singkat (suatu pengalaman yang diceritakan dalam cerpennya, "Sejarah Sulit Kempen yang Gagal" (The Private History of a Campaign That Failed) pada tahun 1885), Clemens menjauhi diri daripada sebarang penglibatan lanjut dengan perang tersebut. Beliau kemudian mengikut Orion ke Bandaraya Virginia di barat pada Julai 1861 ketika abangnya dilantik sebagai setiausaha gabenor wilayah Nevada.